相差显微镜是能将光通过物体时产生的相位差（或光程差）转变为振幅（光强度）变化的显微镜。主要用于观察活细胞、不染色的组织切片或缺少反差的染色标本。
人眼只能鉴别可见光的波长（颜色）和振幅的变化，不能鉴别相位的变化。而大多数生物标本高度透明，光波通过后振幅基本不变，仅存在相位的变化。相差显微镜基本把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差（见图6）。
从结构上看，相差显微镜与普通光学显微镜不同之处在于：
1．环形光阑
具有环形开孔的光阑，安装在光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。
2．相位板
相差显微镜在物镜内部增加了涂有氟化镁的相位板，作用是将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。相位板按工作效果分为两种类型：
（1）A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波叠加，振幅加大，标本结构比周围介质更加明亮，形成亮反差（或称负反差）。
（2）B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，标本结构比周围介质更加暗淡，形成暗反差（或称正反差）。
带有相板的物镜叫相差物镜，常在物镜外壳上标以“Ph”字样。
3．合轴调节望远镜
相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在外壳上标有“CT”符号），用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合，以便实现对直射光和衍射光的特殊处理。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，调节合轴调节望远镜的焦点，视野中会呈现两个圆环，分别是明亮的环状光阑圆环与较暗的相板上共轭面圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节螺旋，使两环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后即可取下合轴调节望远镜，换回目镜。
4．绿色滤光片
用于调整光源的波长。照明光线的波长不同，会引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整。
相差显微镜的使用步骤如下：
① 根据待检标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。
② 将标本玻片放到载物台上，进行光轴中心的调整。
③ 使用合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合后，换回目镜。在观察过程中，每次更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。
④ 加绿色滤光片，按普通光学显微镜的操作步骤进行观察。